生物医药与医疗机械

汉逊酵母表达系统工业化生产技术平台

项目简介: 中科院微生物所经过多年的潜心研究,目前成功开发了一整套能高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统,以及适用于不同基因表达的受体菌,使一些较难表达的基因在其表达平台中获得较好的表达,建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。 该系统可以以多种不同的碳源(甲醇、葡萄糖、甘油)进行诱导发酵,并可在贫氧状态下正常表达外源蛋白,解决了生产中使用纯氧造成的安全性问题,表达产物易于纯化(His-tag标记),表达量高。创建的表达平台己申请专利,使生产单位的知识产权得到保护。 项目现状: 目前该项目组开发的高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统包括19个表达载体,可根据外源基因的种类不同,每升发酵液的表达量可达0.1—10 g,适合大、中、小规模的企业选用。获得专利5项,建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。 (一)重组外源蛋白工业化生产技术平台 项目组采用目前为止外源真核基因表达量最高的汉逊酵母系统表达了乙肝表面抗原、pre-S1-S、pre-S2-S、pre-S1S2-S、治疗性乙肝疫苗、人乳头状瘤病毒L1蛋白、HIV七肽重复区、狂犬病毒G蛋白、霍乱毒素无毒亚单位、mVP1-CTB、、牛促卵泡激素、a干扰素、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、木薯醇晴酶、菊酸乙酯酯酶等基因。采用多拷贝胞内表达和分泌表达等不同的表达方式。发酵诱导后,收获菌体或者表达上清液,经纯化后可获得(纯度>98%)具有生物学活性的外源蛋白。项目组可提供稳定高效表达的工程菌和发酵条件以及参考的提取工艺。 (二)粘膜免疫技术平台 CTB为His-tag标记的霍乱毒素B亚单位,它是迄今为止最强的胃肠道免疫原,能和哺乳动物细胞肠上皮细胞上的GM1结合后,刺激粘膜产生以分泌型IgA为主的保护性抗体,构建了粘膜疫苗平台,以CTB为基础加上不同的抗原表位构成粘膜免疫疫苗。该项目组利用已经建立的Hansenula polymorpha表达系统中的pHFMDHZ-α-A分泌型表达载体,表达了mVP1-CTB。其中mVP1为口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因上的第21-40,135-160,200-213氨基酸,通过人工合成拼接而成,该基因含有T、B细胞表位,能刺激产生保护性T细胞免疫和体液免疫。表达产物免疫Balb/c小鼠后,能产生高效价的IgG(1:10000)和IgA(1:1000)抗体。并能保护Balb/c小鼠和猪对105 LD50剂量的FMDV-O-type的攻击。建立了Hansenula polymorpha-粘膜免疫技术平台。该平台用于预防所有通过粘膜和呼吸系统感染的疾病。其中口蹄疫Hansenula polymorpha酵母粘膜免疫技术已经完全成熟,可以直接进行产业化生产。此平台可用于口服或粘膜免疫疫苗的研发。 (三)汉逊酵母糖基修饰人源化表达平台 在哺乳动物细胞中表达基因工程药物,具有生产成本高、周期长、易于污染人源性致病因子等缺点。因此,对酵母宿主菌的糖基化进行人源化改造,使其完全按照人体内蛋白进行糖基化修饰,将是高新医药领域的一次重大变革。由于该技术是一项平台型技术体系,可以应用于所有治疗性重组蛋白,包括重组抗体。而对于目前的重组抗体,即便是嵌合抗体也有较大的免疫问题,使其成为治疗性抗体的一个瓶颈,因此如果在酵母体内解决人源性问题,将带来重组抗体技术的重大突破。目前国外最近已经完成了毕氏酵母表达人源化抗体的实验室工作,推测1—2年后会出现商品化产品。汉逊酵母人源糖基化问题有望给我国生物技术制药带来新的契机。此项研究正在进行,并取得了实质性进展,有望在近期内完成受体改造,表达出人源糖基化蛋白。 (四)高效筛选平台 由于汉逊酵母随机重组率很高,筛选稳定高表达克隆工作量很大。我们构建了目的基因和筛选基因共表达体系,可以直观筛选高表达株,减少了筛选工作量,缩短筛选周期,可快速高效获得高表达株。 应用领域: 此平台可广泛用于生物医药、食品工业、饲料工业、精细化工、化装品等重组蛋白制品。

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新型动物保健药品的产业化

项目概况: 我国畜牧业的迅猛发展带动了我国动物保健产业的大发展,1986年全国兽药总产值只有8.7亿元,而2002 年的年产值达到了180亿元,比1986年增长了20倍。目前我国已经成为继美国之后的第二大动物保健品消费国,全国已有兽药厂家2800余家,生产各种兽药3000余种。据统计,1亿元以上产值的厂家有19家,4000万元以上的有50家,1000万元以上的有2000家左右,500万元以下的有1300多家。全国已有134个兽药生产企业通过GMP认证,总产量可达2530亿头份,以禽用制品最多,猪次之,宠物第三。 与国外发达国家相比,我国兽用生物制品产业仍然落后很多,存在巨大的市场前景。美国一年兽用生物制品销售额超过46亿美元,另外动物用生物制品在我国大陆仍然是空白。希望我们能够通过这个项目的启动带动生物技术制药在养殖业,宠物保健业的发展,生产研发对人和动物健康安全、无污染、无残留的绿色环保药物。为推动我们国家在新型兽药研究和生产做出贡献。 高活性猪基因工程抗病毒型干扰素类蛋白药物其生物学功能包括广谱抗病毒、增强机体免疫力,强化疫苗免疫效果,减少由于换料、转群等因素引起的应激反应。其适用范围为猪病毒性流行性腹泻、猪流感、水疱病、猪轮状病毒感染、猪传染性胃肠炎、经典蓝耳病等病毒感染,同时可以减少由于换料、转群引起的应激反应,提高机体主动免疫力。 技术创新性: 1、具有广谱抗病毒作用,对于DNA病毒和RNA病毒都有非常好的效果。此外还具有增强免疫等良好的生物活性。 2、能迅速发挥抗病毒作用,注射24小时后,本制剂可以抑制病毒复制,发挥预防和早期治疗的作用。 3、一次用药能维持15-30天,使用方便,优于传统抗病毒药物。 4、可与灭活苗同时使用,能起到弥补免疫空白期、缓解疫苗应激反应、增强免疫效果的作用。 5、生产工艺中解决了干扰素主要原料的纯度问题。同类产品使用的干扰素原料纯度为40%以上,由于纯度不高,可能存在有害蛋白、有害细菌DNA基因或毒素等,从而可能造成药效降低、副作用增加。 项目进展: 1、产品研发生产技术已成熟。目前已经完成了实验室研究、建立中试生产、发酵和纯化工艺,并已连续试制了数十批产品。经实验室效力试验表明,与攻毒对照相比,在病毒感染前、病毒感染潜伏期和发病后使用该制品分别能够使猪病毒性流行性腹泻及蓝耳病的发病率降低40-50%、50-60%、20-30%,死亡率降低20-30%、40%、30%。由于在发病潜伏期内,使用干扰素后能启动机体的抗病毒因子的产生,形成一种网络的保护机制,释放抗病毒蛋白因子,能有效地提高猪体的免疫水平。所以,高活性猪基因工程抗病毒型干扰素类蛋白药物对病毒性感染的猪发病前期有较好的防治效果。临床效力试验中,该制剂对育成猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒等,治愈率基本可达到85%以上。在治愈率方面,本制剂与市面上销售的猪白细胞干扰素相比,同比提高4-5%;且;与未治疗对照组相比,本制剂能明显缩短病程,使患病猪精神和食欲迅速恢复好转,可见,高活性猪基因工程抗病毒型干扰素类蛋白药物对病毒引起的猪胃肠炎具有良好的防治效果。 2、已通过工程菌遗传稳定性试验、生物制品安全性试验、效力试验、临床试验及无菌检查、物理性状检验、有效期检验等试验,各项指标均符合农业部《兽用生物制品规程》要求。目前正处于向国家农业部提交相关资料,申请“治疗用兽用生物制品”批号阶段。 社会经济效益: 保守估算每年生产高活性猪基因工程抗病毒型干扰素类蛋白药物1亿支,1000万单位/支,单价5.0元/支,达产后可实现年销售收入5亿元,利润4.5亿元。

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高温酸性淀粉酶发酵生产关键技术研究

项目概况: 酸性淀粉酶能在酸性条件下水解淀粉,可应用于多种领域,尤其在淀粉糖生产中有着巨大的应用潜力。 淀粉为原料生产葡萄糖过程中,在淀粉液化工艺上由于现有淀粉酶种类的限制,需要将淀粉浆或玉米浆的pH 值由自然的pH4.5 调为pH5.8~6.2 来进行液化,然后再降为p H4.2~4.5 进行糖化。这两步pH 值的调整不仅增加了化学试剂的消耗以及生产成本,而且调整不当会产生大量的副产物,影响最终葡萄糖产品的产量和质量。如能使用与糖化酶最适pH相近的高温酸性α-淀粉酶就可以省去调pH的步骤,即简化了工艺又节约了成本,实现近乎完美的生产工艺。 目前,国内外市场中两类常用的淀粉酶为中温和高温α-淀粉酶,其适用pH范围为6~7,在酸性条件下其酶活明显降低,已不能满足一些酸性条件下淀粉原料的深加工工艺的要求。而酸性α-淀粉酶的工业化生产还是国内的一项空白,开发具有自主知识产权的新酶并实现工业化生产势在必行。 技术创新性: 新型重组酸性高温淀粉酶发酵生产工艺优化及新型重组酸性高温淀粉酶的产业化。 技术研发及产业化发展方向: 使用廉价的合成培养基在发酵罐水平上实现基因工程菌的高密度发酵培养,重组高温酸性淀粉酶的表达量达到500-1000IU/mL发酵液,比摇瓶水平提高5-10倍。为工业化生产打下基础。 社会经济效益: 中科院微生物所利用现代分子生物学技术从高温环境中获得了一种新型高温酸性淀粉酶基因并在大肠杆菌中实现了高效表达。通过与中科院唐山中心的合作运用细菌高密度培养技术实现高温酸性淀粉酶的产业化满足淀粉糖生产中的需要,具有重大的经济、社会和环境效益。 合作方式: 技术开发

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冬虫夏草人工发酵菌丝体生产及深层次开发利用

项目概况: 利用现代生物技术对冬虫夏草进行了菌种驯化、诱导、筛选及保藏等研究。针对冬虫夏草菌嗜低温,生长缓慢的特点,对其进行人工诱导,提高生长温度,研究其生长的营养需求和环境条件,以菌丝生物量和代谢产物分别作为指标进行培养基和培养条件的优化,提高了菌丝体和代谢产物的产率,并按GAP 标准进行了深层发酵,各项指标已经达到中试的要求,相关产品可以为保健品和药品的开发提供原材料。 目前已申请专利两项: 一种冬虫夏草半合成培养基,专利申请号 200410090875.1。 一种冬虫夏草的培养方法及其专用培养基,专利申请号 200510137457.8。 技术创新性: 本研究小组多次前往青藏高原进行野外考察、采集和分离,获得了大量的冬虫夏草标本并掌握了真正冬虫夏草菌种的分离方法。本实验室近年来共分离得到冬虫夏草菌种200余株,成为冬虫夏草菌种资源最为丰富的实验室。同时从形态学和分子生物学两个方面开展了冬虫夏草的系统学研究,建立了冬虫夏草及其相关种类的分子鉴定体系,从而确保本实验室所分菌种的科学性和准确性。在此基础上,开展了冬虫夏草人工发酵及其生物学活性以及菌丝体活性成分的研究。并从实验室丰富的菌种资源中筛选出一株生长快的菌株,对其生长的培养基进行了优化并研究了其生长的最佳环境条件,在摇瓶培养中菌粉的产率达到1.5%以上,超出了我们已知的相关报道。 主要应用范围: 适用于医药、及食品工业 合作方式: 面议

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抗乳腺癌多肽药物:热休克蛋白gp96抑制剂PIBC

项目概况: 本项目为国家一类新药开发项目。乳腺癌的治疗主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗,这几种治疗手段针对不同患者,在临床上通常互相配合使用。靶向治疗是肿瘤治疗的新方法。由罗氏公司开发的 “赫赛汀”就是治疗乳腺癌疗效确切的靶向治疗药物,位居2010年全球药物销量排名第12位的,年销量超过50亿美元。赫赛汀是HER-2蛋白的单克隆抗体,通过与HER-2受体特异性结合,从而影响生长信号的传递;并促进HER-2受体蛋白的内在化降解;同时通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用聚集免疫细胞攻击并杀死肿瘤细胞;另外,它还可以下调血管内皮生长因子和其他血管生长因子活性来抑制肿瘤生长。 该课题组通过前期研究,基于热休克蛋白gp96氨基酸序列及空间构象,设计开发了具有自主知识产权的氨基酸多肽序列,代号为PIBC(Peptide Inhibitor for Breast Cancer),该多肽可以与热休克蛋白gp96结合,通过抑制gp96蛋白空间构象变化,干扰gp96与肿瘤相关受体HER2的相互作用并降低其稳定性、促进HER2在肿瘤细胞中的降解,从而实现抗乳腺癌的临床疗效。本项目开发的PIBC多肽乳腺癌药物与罗氏公司正处于临床试验阶段的抗乳腺癌第二代生物靶向药物帕妥珠单抗(第一代为赫赛汀)具有相同的作用机制,但具有更好的安全性保障。 技术创新性: 热休克蛋白gp96在体内作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程、维持蛋白稳定中发挥重要作用,该课题组研究发现gp96与HER2相互作用,在维持HER2蛋白稳定和功能中发挥核心作用。 该多肽药物通过抑制gp96靶向HER2,具有以下优越性:(1)gp96是该课题组首先发现的治疗乳腺癌的新靶点,有独特的竞争优势;(2)当前乳腺癌患者众多,HER2在乳腺癌等多种恶性肿瘤中均高表达,临床已经证明靶向HER2安全有效;(3)HER2蛋白普遍存在于正常组织中,现有HER2靶向药物存在各种各样的局限性,如肿瘤细胞的耐药性和对人体较大的毒副作用;但gp96只在肿瘤细胞表面表达,靶向肿瘤细胞表面的gp96具有特异性强、安全性高的特点,可开发成新靶向一类新药。 社会经济效益: PIBC抗乳腺癌药物处于国际先进水平,若顺利完成临床试验,预计产品未来具有良好的经济效益,而且具有重大的社会效益。

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gp96新型佐剂乙肝治疗性DNA疫苗

项目概况: 当前慢性乙肝的治疗主要采取核苷(酸)类似物抗病毒治疗和干扰素治疗,取得了比较好的治疗效果,但缺点也十分明显。干扰素治疗只对部分乙肝患者有效;由于靶点的限制,这些药物不能有效的清除病毒cccDNA,停药后存在乙肝病毒 DNA 和转氨酶水平反弹;同时,长时间使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗可导致病毒产生变异耐药毒株,使药物疗效下降,如患者在使用拉咪呋啶后通常在2-3年后产生明显耐药,而且有些核苷(酸)类似物的副作用明显。 在此背景下,国内外有多家科研机构和公司进行乙肝治疗性疫苗的研发,研制乙肝治疗性疫苗可补充甚至替代目前的抗病毒治疗。截至目前,乙肝治疗性疫苗均处于临床前或者临床试验阶段,尚无产品上市。中国现有三个乙肝治疗性疫苗产品在进行临床试验,其有效性有待进一步证实。 本项目为国家一类新药开发项目。以gp96蛋白编码基因质粒、乙肝表面抗原编码基因质粒和乙肝核心蛋白编码基因的质粒为核心组分构成乙肝治疗性DNA疫苗,用于慢性乙肝患者治疗。应用该疫苗进行单一治疗,或与当前其它治疗方法(如抗病毒治疗药物拉咪呋啶等)联用,主要目的是提高乙肝患者e抗原转阴率(即大三阳转为小三阳),大幅降低血液中乙肝病毒DNA滴度;次要目的是刺激乙肝病毒特异性T细胞产生,血清病毒阴转(血清HBsAg转阴)或低水平复制,改善患者生活质量。最优情况下,可能清除患者体内乙肝病毒。 技术创新性: 本项目依托中科院微生物所、中科院病原微生物与免疫学重点实验室田波院士课题组,由多项国家科研经费支持,经多年科研实验,取得了良好的研究成果。 本项目由于改进了乙肝治疗性疫苗的抗原组成,并且增加了gp96热休克蛋白免疫佐剂,因此本项目乙肝治疗性疫苗能打破乙肝免疫耐受,抑制调节性T细胞,激活杀伤性T细胞,从而能够有效促进乙肝e抗原转阴,抑制乙肝病毒复制,达到治疗乙肝的目的。与国内同类产品相比,具有明显的技术先进性。 该项目技术处于国际先进水平,若顺利完成临床试验,中国乙肝患者众多,需医治人群数量庞大,预计产品未来具有良好的经济效益,而且具有重大的社会效益。 合作方式: 技术转让 技术许可 成立公司